生物钟控制着植物体内大部分的生理活动，相关的微阵列表达研究表明，在拟南芥中，有超过三分之一的基因的表达受到内在的生物钟机制的调控(Barak et al., 2000; Covington et al., 2008)，而这一估计还是趋于保守的。植物叶片的运动，气孔的闭合，胚轴的延伸，它可以协调各种生理活动，使得体内的包括生长发育在内的各种生理活动能够在适当的时机进行(Harmer et al., 2000; Mcclung et al., 2001)。以往对生物钟调控网络的研究主要集中在模式植物拟南芥上，在其他植物中相关的研究还比较少见。在拟南芥己经鉴定过多个生物钟调控相关的基因，并且揭示了一些生物钟调控生理途径的机制(李宗飞等, 2015)。

蒺藜苜蓿、百脉根和大豆已先后完成了全基因组测序，可以为我们的分析提供较为完整的基因组数据。在模式植物拟南芥中，我们主要通过GO查找拟南芥生物钟的调控因子，同时根据相关的文献进行补充和佐证。然后将得到的调控因子在全基因组水平上与蒺藜苜蓿，百脉根和大豆这三个物种进行比对，进行相应的生物信息学分析。

1结果与分析

1.1序列联配确定物种间的同源序列

通过检索模式植物拟南芥的生物钟，生物钟调控，生物钟输入等相关GO术语而得到52个基因，其中有些具有多条上述GO注释，去除多重注释的基因，得到42个生物钟调控网络相关的基因，再加上我们从其他文献中得到的8个基因，我们在拟南芥中一共得到了50个生物钟相关的基因。这50个基因基本涵盖了拟南芥的生物钟调控网络的3个部分，包括光信号输入的生物钟途径，中央振荡器组成，以及生物钟调控的一些生理活动。

我们将拟南芥全部基因的蛋白质序列和豆科的3个物种在全基因组水平上分别进行序列相似性比较(表1)，其中“Orthologs”项表示拟南芥中生物钟调控网络相关的基因在各个物种中直系同源候选基因的数目，“全长ORF”项则表示有全长ORF候选基因的数目，“F-PUT”项则表示“全长ORF”项中那些全长被PUT序列覆盖的基因数目。在大豆中一共鉴定了108个生物钟调控网络相关的候选基因，其中有全长ORF的有95个，而有全长PUT序列配比的有66个。在蒺藜苜蓿中一共鉴定了34个生物钟调控网络相关的候选基因，其中有全长ORF的有33个，但是，拥有全长ORF的候选基因中，只有7个基因的全长有PUT序列配比。在百脉根中一共鉴定了51个生物钟调控网络相关的候选基因，其中有全长ORF的有25个，而其中全长PUT序列配比的也只有7个。

从总的情况来看，在豆科这3个物种中，拟南芥中生物钟调控网络相关的基因在大豆中对应的候选基因数目最多，这可能与大豆的多倍体起源有关，同时，大豆中拥有全长PUT序列覆盖的候选基因的数目也要远远多于蒺藜苜蓿和百脉根中相应基因的数目。这可能是大豆中EST数据库中EST资源比蒺藜苜蓿和百脉根EST数据库中多造成的。

同时，PRR9，PHYC，PHYD，LKP2，FSD1 (fe superoxide dismutase 1)，KAT2 (potassium channel in Arabidopsis thaliana 2)，LCL，FLC (flowering locus c)，ARR4 (response regulator 4)，CHE，CO，COL1 (CONSTANS-LIKE 1)这12个拟南芥中生物钟调控网络的相关基因在豆科的3个物种中均没有找到直系同源候选基因。对于这12个基因而言，它们在豆科的直系同源基因已经在豆科的长期进化过程中丢失了，因此，这12个基因可能是造成豆科和十字花科分化的重要事件。

1.2豆科中LHY/CCA1直系同源候选基因的鉴定

LHY和CCA1是一类R1类Myb类型转录因子，在白天达到表达的最高峰，是生物钟中央振荡器的负调控因子，其表达受到TOC1的正向调控。在夜晚，LHY/CCA1受到PIF3 (phytochrome interactingfactor3)的抑制，PIF3 (McWatters et al., 2000)与CCA1和LHY等基因启动子区的G-box结合，进而抑制这些基因的表达；而经红光照射后，PHYB被活化并从细胞质进入细胞核中与PIF3结合，解除PIF3对CCA1和LHY等基因的抑制；并进一步诱导下游日间基因的基因表达并抑制夜间基因的表达。LHY与TOC1等夜间基因的启动子的黑夜元件(AAATATCT)相结合而抑制其的转录表达。在白天，CCA1/LHY表达水平的降低可以逐渐解除其对TOC1的抑制作用，使得TOC1的mRNA表达量的增加。当TOC1的表达量达到一定量的时候，又会正向调控CCA1和LHY的表达，使得CCA1和LHY的表达量增加，从而形成了一个振荡的生理循环。所以，在拟南芥中由CCA1/LHY和TOC1构成的调控途径中，TOC1首先正向调控LHY/CCA1的表达，当LHY/CCA1达到一定的表达量，又会负向抑制TOC1的表达。按照这个模型，MYB转录因子CCA1和LHY是作为转录调控环的负调控元件可以直接结合到TOC1的启动子区域，而TOC1对CCA1和LHY表达的正向调控不是直接的。

LHY在百脉根根和蒺藜苜蓿中都找到位于同一染色体上邻近的2个直系同源基因片段，在大豆中找到了4个直系同源基因(表2)。在百脉根中，有2个预测的基因片段可分别是chr3.CM0208.430.nd和chr3.CM0208.410.nd，在蒺藜苜蓿中，这两个预测的基因片段分别是AC150443_50和AC150443_49。百脉根中的2个基因片段之间相差蒺藜苜蓿中2个基因片段，但是这2个基因片段却无法拼接成一个完整基因，通过与LHY基因的比对可看出，chr3.CM0208.410.nd和AC150443_49对应着LHY基因的HTH保守结构域，而chr3.CM0208.430.nd和AC150443_50则对应着LHY基因的其余部分。出现这种情况，可能有2个原因，一个是基因组信息不全，导致注释错误地将1个基因分成2个基因，另外一种可能性就是在苜蓿属中，在LHY基因的HTH保守结构域与其余部分插入了某个片段，而导致了苜蓿属中LHY基因的功能丧失。我们将这4个基因片段分别去比对百脉根和蒺藜苜蓿中的EST库，结果显示，AC150443_49和AC150443_50的大部分均有EST对应，而chr3.CM0208.410.nd则没有找到相应的EST，而chr3.CM0208.430.nd只有部分区域有EST与之对应。我们将chr3.CM0208.430.nd和AC150443_50分别作为百脉根和蒺藜苜蓿LHY基因的代表，构建进化树，但是，chr3.CM0208.430.nd和AC150443_50在进化树上的位置只能作为一种参考。

LHY在大豆中的4个直系同源候选基因均是全长，与LHY的相似性为42%或者42%以上，并且这4个基因的全长中都有PUT序列覆盖，不过GmLHY1和GmLHY2对应的是同一个PUT序列，GmLHY3和GmLHY4对应的是同一个PUT序列，并且GmLHY2与PUT序列的相似性要大于GmLHY1与PUT序列的相似性，GmLHY3要大于GmLHY4。所以在大豆中至少有2个GmLHY基因的表达。

LHY基因与CCA1同属于R1类MYB转录因子，并且互为旁系同源基因。LHY蛋白的HTH保守结构域非常明显。值得注意的是，在NCBI的CDD结构域分析将LHY蛋白该保守区域命名为SNAT结构域。而Pfam数据库的比对结果表明该结构域为HTH保守结构域，所以，综合以上信息，本研究将该结构域命名为HTH。HTH结构域和SNAT结构域同属于MYB转录因子家族的保守结构域，不同的是，HTH结构域结合的是DNA的特定区域，而SNAT结构域是蛋白质相互作用的识别区域。根据Pfam中的比对和图1结果，在LHY蛋白中，除了HTH这个高度保守性的区域外，从拟南芥LHY蛋白对应的93到473的位点也具有相对保守性，对应着Pfam B类数据库中的120568结构。从氨基酸序列比对图可以看出，HTH的结构域对于维持LHY的功能是非常重要的。即使是在单子叶植物和双子叶植物分离之前，已经和LHY基因分离的拟南芥的CCA1基因在这一区域也是非常保守的。蒺藜苜蓿的情况比较特殊，它的注释信息中LHY基因的HTH结构域的缺失的原因目前还不清楚，有可能是注释信息错误，也有可能是本身LHY发生了某种形式的突变而导致了LHY基因的失活。

拟南芥中的CCA1基因与LHY基因发生分离的重要事件就是在330位点到430位点之间，CCA1基因发生了4小段氨基酸的缺失。而LHY基因在十字花科和豆科分离的重要事件就是在190位点到290位点之间也发生了4小段氨基酸的缺失。在大豆中，从图1中可以得知，GmLHY1和GmLHY2聚为一类，GmLHY3和GmLHY4聚为一类。与GmTOC1的相关的数据相比，GmLHY基因显得更加保守。这也可以从2个同源序列的联配图也可以看出来，LHY基因在同源基因的变化要比TOC1小得多。从氨基酸需类比对图中可以看出，GmLHY1，GmLHY2的分离发生的主要事件在70位点到90位点之间通过某种进化机制引入了20个氨基酸，这个区域位于HTH保守结构域内，应该是一个比较重大的进化事件，其结果目前尚不得而知。有趣的是，这与GmTOC1与GmTOC2的分离情形类似。这也许说明了在相同生理途径中不同基因的趋同进化。

1.3 PRR家族候选基因的鉴定

拟南芥的PRR (pseudo-response regulator, 伪反应调控因子)家族与生物钟有着密切的联系，PRR1 (又名TOC1)，3，5，7，9被称为生物钟五重奏，在控制生物钟的节奏方面有着重要的作用，此外，PRR2在拟南芥的生物钟也起着一定的作用。PRR9在豆科中没有找到直系同源基因，而PRR5在豆科中的同源基较多，并且根据构建的分子进化树，蒺藜苜蓿和大豆的部分PRR5候选基因对应着拟南芥没有的基因(表3)。对于PRR基因数目的变异，是否由拟南芥中的五重奏在其他植物中变为三重奏、七重奏，还需要更多的研究。在拟南芥的PRR家族中，PRR1和PRR2、PRR3、PRR5、PRR7、PRR9的亲缘关系较远，结果表明，PRR基因对生物钟的周期，某个阶段以及幅度，开花时间以及对红光控制的下胚轴的延伸的敏感性都有影响。PRR转录物有节律性的积累，顺序为PRR9-PRR7-PRR5-PRR3-TOC1。其表达最高峰出现在黄昏后2个小时到10个小时从PRR9到TOC1。研究表明PRR参与了生物钟生理途径中的光信号输入途径但是却并不是产生生物钟的节律性振荡所必须的。拟南芥中的PRR7和PRR9基因也在温度介导的生物钟系统中发挥作用，并且2者的功能有重叠。

从保守结构域分析和同源序列联配示意图我们可以看出，植物PRR类基因有2个比较保守的区域，分别是REC区域和CCT区域(图2)。REC区域由2个部分组成，一个是组氨酸蛋白激酶部分，包含磷酸化位点，另一个是蛋白应答调节部分，包括分子间相互作用的识别位点和可能在同源基因或者自身形成二聚化的位点。CCT区域存在于PRR的C-端，负责传递光信号，与B-BOX型锌指结构，GATA型锌指结构，以及REC结构发生作用以调控植物的光信号传导途径。所以，CCT保守区域也存在于光信号途径的其他蛋白中，比如CO, COL蛋白。

PRR1和PRR5在蒺藜苜蓿中没有找到直系同源候选基因，PRR2，PRR7在蒺藜苜蓿中各有一个直系同源基因，PRR2在蒺藜苜蓿中有2个直系同源候选基因。这4个直系同源候选基因在蒺藜苜蓿中均有部分表达。

PRR1在百脉根有1个直系同源候选基因，而PRR2，PRR5，PRR7在百脉根中均有2个直系同源候选基因，其中只有PRR1在百脉根中有部分表达。

PRR1，PRR2在大豆中均有4个直系同源候选基因，PRR5在大豆中有5个直系同源候选基因，PRR7有3个直系同源候选基因，PRR3在大豆中的直系同源候选基因则亲缘关系较远。

在大豆的4个PRR1基因中，GmPRR1a和GmPRR1b聚为一类，GmPRR1c和GmPRR1d聚为一类。GmPRR1c的一个显著的特点就是在REC保守结构域中丢失了部分活化位点和磷酸化位点，这种进化事件发生在GmPRR1c和GmPRR1d分离时。这种结构上的突变有可能使GmPRR1c失去生物活性功能而突变为假基因，也有可能是另外一种进化的结果，GmPRR1c和GmPRR1d的祖先基因在复制后，发生亚功能化(Subfuncional)，使得GmPRR1c丧失部分活性，但是还保留了与其他分子的作用的识别位点和二聚化位点，可能与其他的GmPRR1基因形成二聚体，起辅助作用。从表3中可看出GmPRR1c和GmPRR1d的进化距离(0.096)远大于GmPRR1a和GmPRR1b的进化距离(0.052)，表明GmPRR1c和GmPRR1d分离的时间远早于GmPRR1a和GmPRR1b分离的时间，这就意味着GmPRR1a和GmPRR1b所面临的选择压力大于GmPRR1c和GmPRR1d所面临的选择压力。这也可以从同源序列的联配(图2)比对上看出来，GmPRR1c和GmPRR1d的结构域发生几处缺失，说明他们面临的选择压力少。

1.4 CHE家族候选基因的鉴定

CHE是一种转录因子TCP家族的成员。以往的研究中虽然发现了当CCA1和LHY积累到一定得程度时，就会通过直接结合到TOC1的启动子区域来抑制TOC1的表达，但是与之相反，在TOC1蛋白中，却没有发现相关的功能结构域来调控LHY和CCA1的表达(图3)。为了解决这个问题，Pruneda-Paz等(2009)用酵母单杂交技术来筛选与LHY和CCA1基因调控区域结合的转录因子，结果发现TCP转录因子I类家族专一的结合到CCA1基因起始密码子前面的一段长约171 bp的区域，命名为CHE，但是CHE蛋白却不结合到LHY基因的相关区域。CHE蛋白结合CCA1基因区域的序列为GGNCCCAC，命名为TBS，进一步的研究表明，在白天，CCA1和LHY的高表达促进了CHE的表达，而在夜晚，CHE的表达量不断增加，从而将CCA1和LHY的表达量抑制到最低。在白天结束的时候，TOC1会通过与CHE的结合，来重新开始下一个循环。

CHE基因在豆科的3个物种中均没有找到CHE的直系同源候选基因。蒺藜苜蓿、百脉根和大豆与CHE亲缘关系最近的旁系同源基因分别为AC151824_21、chr5.CM1439.250.Nd和Glyma10g43190，它们在拟南芥中的直系同源均为AT5G23280。这表明有可能在豆科中AT5G23280可能代替了CHE来调控CCA1的表达，或者是在豆科中，AT5G23280调控LHY的表达。

2讨论

本研究采用生物信息学的方法对豆科中的生物钟调控网络进行了分析。利用拟南芥中 Geneontology (GO)注释和最新的文献获得了50个构成生物钟调控网络关键基因，涉及光照和温度等生物钟输入部分，中央振荡器以及生物钟输出等方面。我们一共鉴定了108个大豆的生物钟相关候选基因，51个百脉根的生物钟相关候选基因，34个蒺藜苜蓿的生物钟相关候选基因。

我们从鉴定的直系同源基因的候选基因中选取LHY/CCA1、PRR和CHE基因构建了3个分子进化树，并结合功能结构域和多序列联配的结果，对这些基因的功能和进化趋势进行了分析。我们的分析表明，生物钟调控途径在拟南芥和豆科的这3个物种中发生了不同程度的分化，尤其是在一些关键性的成分比如生物钟调控的核心成分以及控制花期的关键性基因上。而以拟南芥为参照，百脉根和蒺藜苜蓿的生物钟调控网络相关基因的分化程度要大于大豆，这可能是由于百脉根和蒺藜苜蓿的基因组远小于大豆。

3材料与方法

3.1基因组数据来源与获得

蒺藜苜蓿，百脉根和大豆的原始数据的获得和分析以在线为主。表4中列出了4个物种进行在线生物信息学分析的基因组数据库及相应网站。

3.2利用GO (Geneontology)获取拟南芥生物钟调控网络相关基因信息

我们在Gene Ontology上搜寻biological clock，circadian clock，circadian rhythm等关键词，得到表5中的Go术语，再进入TAIR数据库，获得生物钟相关基因的序列及其他相关信息。

3.3直系同源基因的鉴定

用拟南芥中的相关基因的氨基酸序列在豆科这3个物种各自的基因组数据库上进行Blastp或者tBlastn，选取得分在100以上，E值在-30以下的序列为候选序列，将比对结果中相似性最高的序列在NCBI中反向Blastp拟南芥的蛋白质库以确定是否是直系同源基因，如果不是，则表明该基因在该物种没有直系同源基因，如果是，则以该序列为标准，进一步确定其它直系同源基因。

3.4保守结构功能域的分析

综合利用NCBI上的CDD (Marchler-Bauer, 2007) (Conserved Domain Search)对目标序列进行保守结构域的分析。

3.5多序列联配，系统进化树构建和进化分析

利用ClustalX程序(Devlin and Kay, 2001)，对4个物种中的直系同源候选基因进行氨基酸序列比对，采用默认参数。用MEGA4软件(Johnson, 2001; Paloma, 2005)的NJ方法构建系统进化树，自展开1000次，计算进化距离。同时，根据构建的进化树，我们可以大致推算某个基因在豆科和十字花科之间的进化历史。

3.6表达数据的获得和分析

PlantGDB的PUT序列是经过聚类去除冗余并部分拼接为全长cDNA的高质量的EST序列。将直系同源候选基因的核苷酸序列BLASTN比对PUT序列，如果匹配上的PUT序列相似性大于95%，碱基长度长于200 bp，E值小于1E-30，我们则认为该PUT能够证明其匹配的直系同源候选基因部分是真实表达的。我们将EST证据分为3类：F，E，N，F代表整个候选基因有PUT序列覆盖，或者两端有PUT序列覆盖并且整个基因80%的序列被PUT序列覆盖。N表示该基因找不到符合要求的配比PUT序列，E则表示该基因的某个部分或者几个部分有符合要求的PUT序列覆盖，但是还没有达到F的标准。

3.7基因的重新注释

在鉴定豆科中3个物种同源候选基因时，由于基因组信息不全或者注释错误，会出现没有全长ORF的基因。我们将该部分ORF的基因所对应的基因组区域序列在GenScan上重新注释，得到的全长ORF的基因，并将得到的ORF序列重新Blast比对物种相应的PlantGDB的基因组序列，以确认其是否对应着原始的基因组区域；同时将ORF序列翻译的氨基酸序列反向Blastp拟南芥的蛋白质数据库以确认其是否是相关的直系同源基因。

作者贡献

李宗飞是本实验的执行人，负责实验设计、实施、数据分析及论文初稿写作；蔡梦蝶、刘振鹏参与数据分析、初稿的形成、修改；魏芳和张洁参与稿件修改、翻译及文献的校对；方宣钧博士是研究项目的构思者，指导论文的写作及修改。全体作者阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由诸暨市翠溪生物技术研究院(生命科学与生物技术创新基金, No: 201601201)资助。宣佳为本论文稿件进行全文的英文评审。

参考文献

Barak S., Tobin E.M., Andronis C., Sugano S., and Green R.M., 2000, All in good time: The Arabidopsis circadian clock, Trends Plant Sci, 5: 517-522

Covington M.F., Maloof J.N., Straume M., Kay S.A., and Harmer S.L., 2008, Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development, Genome Biol, 9(8): 1

Devlin P.F., and Kay S.A., 2001, Circadian photoperception, Annu. Rev. Physiol, 63: 677-694

Harmer S.L., Hogenesch J.B., Straume M., Chang H., Han B., Zhu T.,Wang X., Kreps J.A., and Kay S.A., 2000, Orchestrated transcription of key pathways in Arabidopsis by the circadian clock, Science 290: 2110-2113

Johnson CH., 2001, Endogenous time keepers in photosynthetic organisms, Annu Rev Physiol, 63: 695-728

Li Z.F., Zhang J., Liu Z.P., and Fang X.J., 2015, Gene Regulation Network of Biological Clock in Plant, Fenzi Zhiwu Yuzhong (online) (Molecular Plant Breeding), 13(1): 1001-1008

Li Z.F., Zhuo W., Liu Z.P., and Fang X.J., 2015, Effects of Gene Regulation of Circadian Clock on Plant Growth and Development, Douke Jiyinzuxue Yu Yichuanxue (online) (Legume Genomics and Genetics), 6(1): 1-4

Marchler-Bauer A., 2007, CDD: a conserved domain database for interactive domain family analysis, Nucleic Acids Res, 35(1): 237-240

McClung C.R., 2001, Circadian rhythms in plants, Annual review of plant biology, 52(1): 139-162

McWatters H.G., Bastow R.M., Hall A., and Millar A.J., 2000, The ELF3 zeitnehmer regulates light signalling to the circadian clock, Nature 408: 716-720

Paloma M., 2005, Circadian clock signaling in Arabidopsis thaliana:from gene expression to physiology and development, Int. J. Dev. Biol., 49: 491-500

Pruneda-Paz J.L., Breton G., Para A., and Kay S.A., 2009, A functional genomics approach reveals CHE as a component of the Arabidopsis circadian clock, Science, 323(5920): 1481-1485